Speziell für MTAs entwickelt, gibt das Buch nicht nur eine praxisnahe Einführung in die Diagnostik, sondern auch ist gleichzeitig eine hervorragende Einführung in die Molekularbiologie und Genetik. Das Buch nimmt somit einen zentralen Platz in der MTA Ausbildung ein. Endlich in zweiter Auflage: das erste deutschsprachige Lehrbuch, das sich umfassend mit der modernen Molekulardiagnostik im medizinischen Labor beschäftigt. Speziell für medizinisch-technische Assistenten entwickelt, gibt das Buch nicht nur eine praxisnahe Einführung in die Diagnostik, sondern vermittelt auch einen hervorragenden Einstieg in die Molekularbiologie und Genetik. Damit nimmt das Buch einen zentralen Platz in der MTA-Ausbildung ein. Beibehalten wurde der Überblick über die derzeit gängigen Methoden, deren theoretische Grundlagen sowie ihre Anwendungsgebiete in der täglichen Praxis. Besonderer Wert wird auf die Vor- und Nachteile der jeweiligen Untersuchungsmethoden bei Praktikabilität, Sensitivität und Spezifität gelegt. Abgerundet wird der praxisnah geschriebene Leitfaden durch ein Glossar sowie eine Übersicht der gesetzlichen Regelungen zur molekularen Labordiagnostik im deutschsprachigen Raum. Vorwort zur 1. Auflage XIII Vorwort zur 2. Auflage XV Autorenliste XVII Glossar XXI Einführung 1 Teil I Allgemeine Grundlagen und Präanalytik 3 1 Grundlagen der molekularen Diagnostik 5Frank Thiemann 1.1 Die DNA 5 1.2 Die RNA 9 1.3 DNA-Replikation 12 1.4 Das Gen 13 1.5 Genomorganisation bei Prokaryonten 14 1.6 Genomorganisation bei Eukaryonten 14 1.7 Die Proteinbiosynthese 16 1.7.1 Die Transkription 16 1.7.2 Die Translation 21 1.8 Grundbegriffe in der molekularen Diagnostik 30 1.8.1 Inzidenz 30 1.8.2 Prävalenz 30 1.8.3 Mortalität 31 1.8.4 Letalität 31 1.8.5 Goldstandard 31 1.8.6 Richtigkeit und Präzision 31 1.8.7 Sensitivität und Spezifität 32 1.8.8 Prädiktiver Wert 34 2 Präanalytik in der molekularen Diagnostik 37Frank Thiemann 2.1 Administrative Maßnahmen 37 2.2 Probengewinnung 38 2.2.1 Zeitpunkt der Probengewinnung 39 2.2.2 Proben- und Transportröhrchen 41 2.3 Hinweise zu Transport und Verpackung 45 2.3.1 Kategorie A UN 2814 45 2.3.2 Kategorie B UN 3373 46 2.3.3 Freigestellte medizinische Proben 46 2.4 Präanalytische Schritte im Labor 46 2.4.1 Räumliche Voraussetzungen 47 2.4.2 Vollautomatische Analysesysteme 49 Teil II Methoden 51 3 Isolierung von Nukleinsäuren 53Edgar Setzke und Hans Nitschko 3.1 Einleitung 53 3.2 Die Probenvorbereitung 53 3.3 Der Zellaufschluss in Abhängigkeit des Probenmaterialsund der zu isolierenden Nukleinsäure 55 3.4 Isolierung von DNA 56 3.4.1 Phenol/Chloroform-Extraktion 56 3.4.2 Silikamembranen oder mit Silika beschichteteOberflächen (magnetische Partikel) 57 3.4.3 Anionenaustauscher-Säulen 61 3.5 Isolierung von RNA 63 3.5.1 Isolierung von Virus-RNA 63 3.5.2 Isolierung von zellulärer RNA 64 3.6 Manuelle und automatisierte Systeme zurNukleinsäureisolierung in der molekularen Diagnostik 65 3.6.1 Manuelle Extraktionssysteme 66 3.6.2 Automatisierte Extraktionssysteme 68 3.7 Überprüfung der Menge, Reinheit und Qualitätvon RNA und DNA 72 3.7.1 Photometrische Bestimmung der Nukleinsäure[Menge/(Reinheit)] 73 3.7.2 Abschätzung der DNA-Menge durch Gelelektrophorese undAnfärbung mit Ethidiumbromid oder anderen Farbstoffen[Menge/(Qualität)] 73 3.7.3 Bioanalyzer [Menge/Qualität] 74 3.7.4 Spotmethode [Menge] 75 3.7.5 DNA/Zellzahlbestimmung durch PCR genomischer Sequenzen[Menge] 76 3.8 Lagerung der isolierten RNA/DNA 77 3.8.1 Lagerung von Standards 78 4 Amplifikation und Detektion von Nukleinsäuren 79Stefan Lorkowski, Ofert Landt, Carsten Tiemann, MichaelWeizenegger, Ulrich Eigner, Charlotte Sager, Frank Thiemann undPaul M. Cullen 4.1 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 79 4.1.1 Geschichtlicher Hintergrund 79 4.1.2 Das Prinzip der PCR 80 4.1.3 Die Komponenten der PCR 85 4.1.4 Anforderungen an das Ausgangsmaterial 89 4.1.5 PCR-Zusätze 91 4.1.6 Weitere PCR-Methoden 92 4.2 Entwicklung (Design) von Real time-PCR Assays: Primerauswahlund Sonden 99 4.2.1 Grundsätze 100 4.2.2 Primer 100 4.2.3 Sonden 102 4.2.4 Farbstoffe und Multiplex-PCR 103 4.2.5 Kriterien der Leistungsbewertung 103 4.3 Detektion von PCR-Produkten 106 4.3.1 Agarosegelelektrophorese 106 4.3.2 Chip-Elektrophorese (Lab-on-a-Chip) 109 4.3.3 PCR-ELISA und partikelbasierte Detektion 110 4.3.4 Reverse Hybridisierung 114 4.3.5 HyBeacon-Technologie 118 4.4 Real time-PCR 121 4.4.1 Interkalierende Farbstoffe (SYBR) 121 4.4.2 TaqMan-Sonden 122 4.4.3 Dark Quencher (BHQ, black hole quencher) 123 4.4.4 MGB-Sonden (minor grove binder) 123 4.4.5 Molecular Beacons 124 4.4.6 Modifizierte Oligonukleotidbausteine 124 4.4.7 Hybridisierungsproben 125 4.4.8 Scorpion-Primer 126 4.4.9 Schmelzpunktanalytik 127 4.4.10 High Resolution Melt (HRM) 128 4.4.11 Miniaturisierte Technik 129 4.4.12 Quantitative PCR 129 4.4.13 Absolute Quantifizierung 130 4.4.14 Relative Quantifizierung 132 4.4.15 Dual Target 133 4.4.16 Digitale PCR (dPCR) 134 4.5 Multiplex-PCR 135 4.5.1 Mit Dual Priming -Oligonukleotiden derMultiplex-PCR auf die Sprünge helfen 137 4.5.2 MLPA als Werkzeug für die Multiplex-PCR 140 4.5.3 Wenn es etwas mehr sein soll: Multiplex-PCR mit Luminex144 4.5.4 Multiplex-PCR: Die Qual der Wahl 149 4.6 Weitere Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren 149 4.6.1 DNA-Sonden-Assays (Gensonden) 150 4.6.2 Transcription-Mediated Amplifikation (TMA) 150 4.6.3 Hybridization Protection Assay (HPA) 153 4.6.4 Nucleic Acid Sequence based Amplifikation (NASBA) 154 4.6.5 Strand-Displacement Amplification (SDA) 156 4.6.6 Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) 158 4.6.7 Massenspektrometrie als neue Option 158 4.6.8 Das Prinzip 162 4.6.9 Massenspektrometrie im PCR-Labor 164 4.6.10 Die Target-Regionen und ihre Analyse 167 4.6.10.1 Der Einsatz im Routinelabor 169 4.7 DNA-Mikroarrays 170 5 DNA-Sequenzierung 173Andre Frontzek 5.1 DNA-Sequenzierung nach Sanger 173 5.2 Pyrosequenzierung 180 5.3 Minisequenzierung 183 5.4 Sequenzierung mit Mikroarrays 185 5.5 Sequenzierung die nächste Generation 186 5.6 Die Zukunft der Sequenzierung 191 Teil III Indikationen 193 6 Indikationen für die molekulare Diagnostik 195Holger F. Rabenau, Udo Reischl, Uwe Lang, Matthias Aymanns, TimHagedorn, Kim Koop, Jana Schröder und AndreasUekötter 6.1 Erkrankungen durch Viren 198 6.2 Erkrankungen durch Bakterien, Pilze und Parasiten 221 6.3 Molekulare Methoden in der Krankenhaushygiene 227 6.3.1 Bedeutung der Krankenhaushygiene in Deutschland 227 6.3.2 Gesetzliche Rahmenbedingungen 228 6.3.3 Molekularbiologische Erregersuchtests 229 6.3.4 Molekulare Typisierungsmethoden in der Krankenhaushygiene231 7 Humangenetik 235Hanns-Georg Klein, Imma Rost, Christoph Marschall, Karin Mayer,Sebastian Eck, Ina Vogl, Christina Sofeso, Camilla Ladinig,Wolfgang Rupprecht, Paul M. Cullen, Brigitte Welling, Uwe Heinrich,Annett Wagner, Tanja Hinrichsen, Thomas Harasim und BirgitBusse 7.1 Klinische Genetik 236 7.1.1 Gesetzliche Rahmenbedingungen 236 7.1.2 Genetische Beratung 237 7.1.3 Erbgänge 239 7.2 Molekulargenetik 241 7.2.1 Monogene Erkrankungen 241 7.2.2 Next Generation Sequencing in der Diagnostik 247 7.3 Prädispositionsdiagnostik 250 7.3.1 Prädispositionsdiagnostik für polygeneErkrankungen 251 7.4 Klassische und molekulare Zytogenetik 261 7.4.1 Postnataldiagnostik 261 7.4.2 Pränataldiagnostik 267 7.4.3 Tumorzytogenetik 268 7.4.4 Molekulare Zytogenetik 271 7.5 Nicht invasiver Pränataltest (NIPT) 276 7.6 Reproduktionsgenetik 278 7.6.1 Polkörperdiagnostik Präimplantationsdiagnostik 278 7.7 Pharmakogenetik 282 7.7.1 Verstoffwechselung von Arzneimitteln 283 7.7.2 Transportproteine 285 7.7.3 Pharmakogenetik in der Routinediagnostik 285 7.8 Abstammungsanalysen 286 7.8.1 Gesetzliche Grundlagen 288 7.8.2 Weitere Anwendungen von Mikrosatellitenanalysen 288 8 Immungenetik und Transfusionsmedizin 291Hannah Rabenstein, Kristin Kipper, Barbara Bangol und KaimoHirv 8.1 MHC-Komplex und HLA-System 291 8.1.1 Klinische Bedeutung der HLA-Typisierung 292 8.1.2 Methodische Aspekte der HLA-Typisierung 295 8.2 Primäre Immundefekterkrankungen 298 8.3 Hereditäre periodische Fiebersyndrome 299 9 Molekulare Onkologie und Pathologie 301Tanja Hinrichsen, Stefanie Kühner, Oliver Wachter undBarbara Dockhorn-Dworniczak 9.1 Leukämien 302 9.1.1 Ablauf einer genetischen Diagnostik am Beispiel derchronischen myeloischen Leukämie (CML) 303 9.2 Solide Tumore 307 9.2.1 Kolorektales Karzinom (KRK) 308 Teil IV Qualität 313 10 Qualitätssicherung in der molekularen Diagnostik315Holger F. Rabenau und Udo Reischl 10.1 Präanalytik 317 10.1.1 Labortechnische und -organistorische Voraussetzungen317 10.1.2 Kontrollen 317 10.2 Validierungen von molekularbiologischen Verfahren 318 10.3 NAT-spezifische Aspekte der Qualitätssicherung RiLiBÄK 2013 321 Gesetze und Normen zur Regelung der molekularen Labordiagnostikim deutschsprachigen Raum 323 Paul M. Cullen und Michael Neumaier EU-Richtlinie 98/79/EG über In vitro-Diagnostik 323 Besondere Bedeutung der EU-Richtlinie für dieMolekulardiagnostik 325 Regelung von Nukleinsäureamplifikationstechniken (NAT) beider Diagnose von Infektionskrankheiten 325 Das deutsche Gendiagnostikgesetz 325 Aufbau und Inhalt des Gendiagnostikgesetzes 326 Was vom Gendiagnostikgesetz nicht geregelt wird 326 Was vom Gendiagnostikgesetz geregelt wird 326 Anwendung des Gendiagnostikgesetzes was in dertäglichen Praxis beachtet werden muss 327 Gendiagnostikgesetz: Kritik, Interpretation und Modifikationen333 Weiterführende Literatur 337 Index 341